PCR檢測植物病毒感染

PCR檢測植物病毒感染

原始設計者：彰師大

觀察植物在特定病毒感染後病徵，並利用PCR技術檢測植物是否有被病毒感染。

實驗材料:

• 葉片 數片
• 1.5 ml 離心管 3/個
• 廢液杯 1/個
• 離心機 1/個
• tip 1/個
• Rank 1/個
• 電子秤 1/個
• 打洞器 1/個
• 微量離心管 1/個
• Master mix(Taq, buffer, dNTP, dye) 10/µL
• TE buffer 100/ml
• Primer F’ 4/µL
• Primer R’ 4/µL
• ddH2O 1/µL
• PCR machine 1/台
• 電泳槽 1/台

1.現象說明：

1.Potato virus 馬鈴薯微嵌紋病毒

病毒顆粒為絲狀彎曲 ( Transmission electron micrographs)。PVX 感染茄科植物其病徵表現主要為系統性，感染藜科（Chenopodiaceae）或莧科（Amaranthaceae）後會造成局部性病斑（local lesions），也會感染部分豆科植物（Leguminosae）。
病徵：

• 1.1潛伏感染，並無明顯症狀

• 1.2輕微：斑駁

• 1.3嚴重：
  • 皺葉嵌紋
  • 植株矮化
  • 新生葉片小化
  • 植株頂端、塊莖大量壞疽，植株死亡

　

2.Tobacco mosaic virus 煙草嵌紋病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵：

• 葉部呈現不規則之暗綠色與淡綠嵌紋，嵌紋邊緣多為波浪狀

• 葉片細胞壞疽

• 葉片向下捲曲
  • 在菸草(Nt)過敏反應(NN vs nn)

　

3.Tomato leaf curl Taiwan virus 台灣番茄捲葉病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵：

• 植株嚴重矮化
• 葉片明顯朝上捲起、變形
• 從葉緣及中肋附近區域明顯黃化現象
• 花枯萎現象
• 罹病植株結果很少；開花期以前罹染此病毒幾乎無法結果

2.探究問題：（此為引導，學習者必須要提出合理的假說）

• 2.1 病毒如何感染植物？
• 2.2 如何判斷引發植物病變的成因？？
• 2.3

3.實作項目

1.萃取DNA：

• 1. 利用打洞器裁出 3-5 mm直徑的葉片

• 2. 將 1 片葉片放入1.5 ml離心管中，加入100 μl 溶劑
  • 註：不要研磨葉片

• 3. 65 ℃加熱5分鐘  98 ℃加熱2分鐘

• 4. 置於冰上2分鐘

• 5. 所得液體即為萃取液

• 6. 進行濃度測定

2.PCR：
加19 ml混合液於PCR tube後，再加1 ml DNA

3.電泳：

• 1.Marker加入2 ml

• 2.控制組與實驗組分別加入5 ml

• 3.設定電壓與時間，95V 跑 35分鐘

• 4.外染

• 5.利用UV光照膠

4.分析與結論

• 4.1 由各組在不同光條件下種子萌芽的反應，可推得Pr、Pfr與種子萌發的關係
• 4.2 照射紅光Pfr轉換成Pr，Pr促進好光性種子萌發，則發芽率較高。
• 4.3 在組別4中，照射紅光再照射遠紅光，Pfr抑制好光性種子萌發，發芽率較低，證明Pr、Pfr之間可互相轉換。

5.教學目標與評量

• 5.1 了解光敏素的類別及影響種子萌芽的機制
• 5.2 透過不同光條件下的實驗結果，可得知光敏素與種子萌發的關係。
• 5.3 學習準備工作與實驗的操作方式。