植物開花調控分析實驗

以植物形態發育學與生理方法，分析植物由營養生長期進入生殖生長期後之變化與調控。 實驗材料: 實驗器材 數量 解剖顯微鏡 1台 9 cm培養皿 1個 鑷子 1個 甲、乙、丙、丁四種果實樣本 各1份 阿拉伯芥植物 (戊、己、庚） 各1株 1 mL水之封口袋 2份 硝酸鹽試紙 (憑卷領取) 4份 Bradford試劑 4個 牙簽 2支 滴管 1支 1 mL 針筒(定量用) 1支 塑膠杯 (裝廢液) 1個

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1.現象說明：

• 調控植物開花由營養生長期轉變為生殖生長期主要由光週期、低溫春化作用、吉貝素、自發性機制所控制，進而誘導開花素蛋白（Flowering Locus T, FT）的表現與移動。FT蛋白於葉子韌皮部形成，經篩管運輸至莖頂，進而開始花組織器官的分化與發育，雄蕊花粉藉由雌蕊柱頭進行授粉後，花朵子房開始發育而成為果實，其中營養鹽例如：硝酸鹽的轉運也在開花結果時扮演重要角色，本實驗操作題以模式植物阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）為材料。

2.初探與假說：（此為引導，學習者必須要提出合理的假說）

• 2.1 請以解剖顯微鏡觀察分析阿拉伯芥花朵有幾片花瓣？幾枚雄蕊？幾個雌蕊？
• 2.2 請以解剖顯微鏡觀察與比較阿拉伯芥花朵受粉前、後柱頭之差異？並說明柱頭形態在授粉前後之變化與功能的關聯性為何？
• 2.3 請解剖阿拉伯芥果實後，進行觀察。比較阿拉伯芥果實解剖構造與甲、乙、丙、丁四種果實樣本，請問阿拉伯芥果實與何者最為類似？
• 2.4 近年研究發現在阿拉伯芥開花分子調控中，微RNA（micro RNA）也扮演重要角色可調控mRNA表現量， miRNA可調控並降解mRNA，以達到抑制mRNA表現量之效果。何者分子大量表現後，與野生型相較，可助於提早開花？何者分子大量表現後，與野生型相較，將延遲開花？
• 2.5 實驗材料中三株阿拉伯芥植物分別編號為戊、己、庚，請分析比較開花先後順序，推論何者為野生型、miR172大量表現株、miR156大量表現株？
• 2.6 請以植株營養葉之葉片數量，來定量3株植物開花先後順序為何？
• 2.7 請取野生型阿拉伯芥植株並分別測量營養葉片與果實之硝酸鹽與蛋白質含量，並說明硝酸鹽在開花結果時如何轉運？

3.設計實驗與執行

3.1 以解剖顯微鏡觀察分析阿拉伯芥花朵： 3.1.1 有幾片花瓣？ 3.1.2 有幾枚雄蕊？ 3.1.3 有幾枚雌蕊？
3.2 以解剖顯微鏡觀察與比較阿拉伯芥花朵受粉前、後柱頭之差異： 3.2.1 請描繪出授粉前、後柱頭之形態？ 3.2.2 說明柱頭形態在授粉前後之變化與功能的關聯性為何？
3.3 解剖阿拉伯芥果實： 3.3.1 請畫出中段橫切面之構造？ 3.3.2 請問阿拉伯芥果實由幾個心皮發育而成？ 3.3.3 請以心皮數量為依據，比較阿拉伯芥果實解剖構造與甲、乙、丙、丁四種果實樣本，請問阿拉伯芥果實與何者最為類似？
3.4 近年研究發現在阿拉伯芥開花分子調控中，微RNA（micro RNA）也扮演重要角色可調控mRNA表現量， miRNA可調控並降解mRNA，以達到抑制mRNA表現量之效果， 請參考右圖一： 3.4.1 何者分子大量表現後，與野生型相較，可助於提早開花？ 3.4.2 何者分子大量表現後，與野生型相較，將延遲開花？
3.5 實驗材料中三株阿拉伯芥植物分別編號為戊、己、庚，分析比較開花先後順序： 3.5.1 推論何者為野生型、miR172大量表現株、miR156大量表現株，請填入表一？ 表一：阿拉伯芥基因轉殖株之開花調控性狀分析 野生型 miR172大量表現株 miR156大量表現株
3.6 請以植株營養葉之葉片數量，來定量表一中3株植物開花先後順序 3.6.1 作圖並標註縱軸與橫軸之項目及單位
3.7 請取野生型阿拉伯芥植株並分別測量營養葉片與果實之硝酸鹽與蛋白質含量，並說明硝酸鹽在開花結果時如何轉運，請依下列方法進行實驗分析： 3.7.1 請先取3片最年輕之營養葉片，並在裝有1 mL水之封口袋內進行搓揉以研磨組織；相同之研磨法搓揉以研磨等重果實（由下而上取約10個）。 3.7.2 硝酸鹽以硝酸鹽試紙測定並進行比色以定量濃度（請參照圖二）。 3.7.3 將適量約2滴萃取液滴在硝酸鹽試紙上，反應約1分鐘後進行比色定量。 3.7.4 蛋白質以Bradford試劑測定並進行比色以定量濃度（請參照圖三） 。 3.7.5 將0.2 mL萃取液加入0.5 mL Bradford試劑，反應1分鐘後進行比色定量。 圖二：硝酸鹽之測定與試紙比色濃度 圖三：蛋白質之測定與試劑比色濃度 3.7.6 請完成下表二，並依此結果推論硝酸鹽與蛋白質在植株開花結果時之轉運方向與硝酸鹽及蛋白質在營養葉與果實變化為何？ 表二：硝酸鹽與蛋白質在植株開花結果時之轉運與變化 營養葉 果實 硝酸鹽濃度PPM 蛋白質濃度 μg/mL

4.分析與結論

• 4.1 能從觀察到的植株外觀並記錄圖表與數據。
• 4.2 能藉由比色定量之方法推論蛋白質與硝酸鹽在植株中的含量變化。

5.教學目標與評量

• 能透過觀察阿拉伯芥之外表形與生理變化，紀錄數據、繪製圖表。
• 能從實驗的結果推論阿拉伯芥的生長因子的調控情形。

6.參考資料：

• Yamaguchi Y and Abe M (2012 )Regulation of reproductive development by non-coding RNA in Arabidopsis: to flower or not to flower J Plant Res. 125: 693–704.
• Lin CC, Fu SF, Liu YJ, Chen CC, Chang CH, Yang YW and Hao-Jen Huang (2019) Analysis of ambient temperature-responsive transcriptome in shoot apical meristem of heat-tolerant and heat-sensitive broccoli inbred lines during floral head formation. BMC Plant Biology 19: 3.

7.解答：

• 3.1以解剖顯微鏡觀察分析阿拉伯芥花朵：

4片花瓣；6雄蕊；1雌蕊

• 3.2以解剖顯微鏡觀察與比較阿拉伯芥花朵受粉前、後柱頭之差異

3.2.1授粉前、後柱頭之形態

3.2.2柱頭形態在授粉前後之變化與功能的關聯性

授粉前雌蕊柱頭光滑呈閉合狀/ 尚無法接受花粉

授粉後雌蕊柱頭有細微凸起呈開放狀/ 可接受花粉

• 3.3解剖阿拉伯芥果實：

3.3.1中段橫切面之構造

3.3.2阿拉伯芥果實由幾個心皮發育而成？2個

3.3.3請以心皮數量為依據，比較阿拉伯芥果實解剖構造與甲、乙、丙、丁四種果實樣本，請問阿拉伯芥果實與何者最為類似？乙

• 3.4近年研究發現在阿拉伯芥開花分子調控中，微RNA（micro RNA）也扮演重要角色可調控mRNA表現量， miRNA可調控並降解mRNA，以達到抑制mRNA表現量之效果：

3.4.1何者分子大量表現後，與野生型相較，可助於提早開花？ BCEFG

3.4.2何者分子大量表現後，與野生型相較，將延遲開花？AD

• 3.5實驗材料中三株阿拉伯芥植物分別編號為戊、己、庚，分析比較開花先後順序

表一：阿拉伯芥基因轉殖株之開花調控性狀分析 請填入代號戊、己、庚

野生型	miR172大量表現株	miR156大量表現株
庚	己	戊

• 3.6請以植株營養葉之葉片數量，來定量3株植物開花先後順序

3.7請取野生型阿拉伯芥植株並分別測量營養葉片與果實之硝酸鹽與蛋白質含量，並說明硝酸鹽在開花結果時如何轉運： 表二：硝酸鹽與蛋白質在植株開花結果時之轉運與變化 miR172營養葉 果實 硝酸鹽濃度PPM 250~500 10~50 蛋白質濃度 μg/mL 5~20 50~200 推論硝酸鹽轉運至葉部進行同化作用後合成胺基酸，再以蛋白質型式儲存於果實中。