PCR檢測茉莉香米

PCR檢測茉莉香米

原始設計者：彰師大

了解香米之所以香是帶有突變基因，並且抽取香米及一般米DNA，並經由聚合酶連鎖反應、電泳膠，觀察其膠圖之差異。

實驗材料:

• 研缽 1
• 1.5 ml 離心管 3
• 廢液杯 1
• tip 1
• 離心機 1
• Rank 1
• 電子秤 1
• 香米 0.1 g
• 一般米 0.1 g
• 微量離心管 1個
• Master mix(Taq, buffer, dNTP, dye) 10µL
• H2O 1µL
• ESP 2.5µL
• IFAP 2.5µL
• EAP 2.5µL
• INSP 2.5µL
• PCR machine 1
• 電泳槽 1

1.現象說明：

稻米的分類：

1.依香氣分類

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

泰國 Jasmine 香米	印度 Basmati 香米	台灣 益全香米

2.依米質(胚乳)的特性

• 茉莉香米 Jasmine rice

• 1. 屬於秈稻，具茉莉花香
• 2. 香味原因：基因 BAD2 失去功能，造成 2AP 累積
• 3. 香味源自揮發物 2-acetyl-1-pyrroline (2AP)
• 4. 2AP 由脯氨酸 proline 和鳥氨酸ornithine代謝而成的衍生物

• 香米為何而香？
  

 泰國科學家近日宣布，他們已經分析獲得了泰國香米基因圖譜中的『致香』環節，並且已經在美國專利與商標局申請了專利。由此，泰國准備人工改良其他普通大米，使之也具有香米的獨特芳香。

 泰國大米基因項目負責人阿皮差·旺納威吉29日在曼谷表示，自去年底泰國國家基因工程中心和泰國農業大學攜手繪制出泰國茉莉花香米的基因圖譜後，科學家們一直在研究圖譜中的『致香』環節。這一難點的突破有助於農產品的改良。

 泰國國家基因工程中心主任馬拉格·探提差龍說，為了研究泰國茉莉花香米，研究人員花費了數月時間終於在其基因圖譜中找到了引發這種香米散發出獨特茉莉花香的基因部分。他說，通過類比移植的方法可以使其他品種的大米也散發出香米的氣味。

 馬拉格說，研究發現，香米之所以香，其實是因為發生了基因突變。通俗說來，香米實際上包含有非正常基因。以泰國茉莉花香米為例，在它的基因圖譜中，有8個基因處於『停工』狀態。也就是說，這8個形同擺設的基因正是引發這種大米散發出茉莉花香的最主要原因。

 大米基因組由約5000個基因組成。泰國科學家說，他們目前正在研究，是否可以將其他大米基因組中相同位置的8個基因『人工破壞』，使其處於『停工』狀態，從而達到改普通米為香米的目的。

 馬拉格說，這一發現對於泰國農業具有相當重要的意義。通過相同的方法，一些普通品種的玉米、稻谷、小麥、豆子和椰子都可以得到人工改良，從而提高質量和產量。(來源：新華社)

2.探究問題：（此為引導，學習者必須要提出合理的假說）

• 2.1 觀察「萃取DNA膠圖」後標示組別與樣本種類，並寫出從膠圖中看到什麼結果？
• 2.2 標示NanoDrop測量結果，並分析你所抽取的DNA品質如何。
• 2.3 觀察「PCR膠圖」後標示組別，並寫出從膠圖中看到什麼結果？
• 2.4 查查看，池上米？越光米？台秈OO號？台農OO號？桃園OO號？壽司米？台灣米的名字種類很多，為什麼這樣命名？是依據什麼做的分類？
• 2.5 想想看，若將延長(extension)的溫度下調至36℃，會不會影響實驗結果？為什麼？

3.實作項目

• 1.萃取DNA

• 1. 取10粒米切取胚芽部分放入研缽。

加BashingBead buffer 750 ul研磨。(打破細胞)

• 2. 移入BashingBead tube。

加Proteinase K 1 ul。(分解蛋白質)
65 ℃ 水浴 10 min。
10,000 rpm 離心 1 min。(移除雜質)

• 3. 取上清液500 ul加入III-F filter+ collection tube。
  

8,000 rpm 離心 1 min。(過濾雜質)

• 4. 移除III-F filter。
• 5. 在collection tube中，加入Lysis buffer 1500 ul。(打開DNA＋準備Binding)
  

和過濾液充分混合。

• 6. 取混合液 800 ul。(DNA Binding在膜上)
  

加入II-C column+ collection tube。
10,000 rpm 離心 1 min。

• 7. 倒掉濾液。
  

重複step 6兩次。

• 8. 把II-C column移至新的collection tube。
  

加入Pre-wash buffer 200 ul。(去除糖類、蛋白質)
10,000 rpm 離心 1 min。

• 9. 倒掉濾液。
  

加入Wash buffer 500 ul。(去除糖類、蛋白質)
10,000 rpm 離心 1 min。

• 10. 把II-C column移至新的eppendorf。

加入Elution buffer 20 ul。(回溶DNA)
10,000 rpm 離心 30 sec。

• 11. 取HRC-filter+ collection tube。
  

加入Prep solution 600 ul。
8,000 rpm 離心 3 min。

• 12. 把HRC-filter移至新的eppendorf。(去除酚類)
  

加入剛剛Elute的DNA 20 ul。
15,000 rpm 離心 3 min。

• 13. 標上組別， -20 ℃保存。

• 14. 測DNA濃度(NanoDrop)

• 15. 跑2%電泳

• 跑PCR

• 1. PCR 試劑配置-四要素
  

Taq polymerase最適合的extension溫度是72℃

• 2. PCR 試劑配置
  

• 3. PCR 條件

• 4. 電泳跑膠

4.分析與結論

• 4.1 從萃取DNA膠圖中判斷是否有抽出DNA。
• 4.2 從PCR膠圖中判斷樣本是BAD2基因是否正常，並判斷是否與預期結果相同。
• 4.3 若PCR膠圖有585bp和355bp兩條bands，則代表此為純品系一般米DNA；若膠圖中有577bp和257bp兩條bands，則為純品系香米DNA；若同時具有585bp、355bp和257bp，則為異型合子的一般米。

5.教學目標與評量

• 5.1 了解香米具有香氣的原因是由於BAD2的缺損。
• 5.2 能熟悉DNA萃取的操作方式。
• 5.3 能從Nano drop的結果判斷DNA品質好壞。
• 5.4 熟悉PCR和電泳的操作方式。
• 5.5 能從PCR膠圖判斷樣品的種類。

7.參考說明：

• 萃取DNA膠圖
  

• PCR膠圖