光敏素對種子發芽率影響

原始設計者：彰師大

探討光敏素 Pr、Pfr對好光性植物種子萌發的關係。

實驗材料:

苜蓿芽種子 20粒
培養盤 4個
厚紙巾 4張
水適量
鋁箔 8張
手電筒 2個
紅色透明玻璃紙 2張
藍色透明玻璃紙 4張
綠色透明玻璃紙 1張
紅色透明玻璃紙 2張

1.現象說明：

1.光敏素（phytochrome）

　植物細胞中含量稀少的藍綠色素，成分為蛋白質，分為鈍化型（proteinred, Pr）和活化型（proteinfar-red, Pfr）兩種型態，分別吸收紅光和遠紅光而互相轉換。植物主要透過光敏素接收外界光的信號來調節本身的生長、發育和開花。過去知道在晚上，Pfr構形的光敏素會慢慢回到Pr構形；這個過程稱為黑暗回復（dark reversion）　　

2.光敏素的作用

2.1光週期性植物的開花誘導

Pfr < Pr 促進短日照；抑制長日照

Pfr > Pr 抑制短日照；促進長日照

2.2 種子的萌發

Pfr 促進感光性種子萌發

Pr 抑制感光性種子萌發

2.3 幼苗的生長

Pfr促進葉綠素、胡蘿蔔素、花青素合成；葉綠體的形成；子葉、葉、莖的生長

3.實作項目

1.萃取DNA

1. 取10粒米切取胚芽部分放入研缽。

加BashingBead buffer 750 ul研磨。(打破細胞)

2. 移入BashingBead tube。

加Proteinase K 1 ul。(分解蛋白質)
65 ℃ 水浴 10 min。
10,000 rpm 離心 1 min。(移除雜質)

3. 取上清液500 ul加入III-F filter+ collection tube。

8,000 rpm 離心 1 min。(過濾雜質)

4. 移除III-F filter。
5. 在collection tube中，加入Lysis buffer 1500 ul。(打開DNA＋準備Binding)

和過濾液充分混合。

6. 取混合液 800 ul。(DNA Binding在膜上)

加入II-C column+ collection tube。
10,000 rpm 離心 1 min。

7. 倒掉濾液。

重複step 6兩次。

8. 把II-C column移至新的collection tube。

加入Pre-wash buffer 200 ul。(去除糖類、蛋白質)
10,000 rpm 離心 1 min。

9. 倒掉濾液。

加入Wash buffer 500 ul。(去除糖類、蛋白質)
10,000 rpm 離心 1 min。

10. 把II-C column移至新的eppendorf。

加入Elution buffer 20 ul。(回溶DNA)
10,000 rpm 離心 30 sec。

11. 取HRC-filter+ collection tube。

加入Prep solution 600 ul。
8,000 rpm 離心 3 min。

12. 把HRC-filter移至新的eppendorf。(去除酚類)

加入剛剛Elute的DNA 20 ul。
15,000 rpm 離心 3 min。

13. 標上組別， -20 ℃保存。

14. 測DNA濃度(NanoDrop)

15. 跑2%電泳

跑PCR

1. PCR 試劑配置-四要素

Taq polymerase最適合的extension溫度是72℃

2. PCR 試劑配置

3. PCR 條件

4. 電泳跑膠

4.分析與結論

4.1 從萃取DNA膠圖中判斷是否有抽出DNA。
4.2 從PCR膠圖中判斷樣本是BAD2基因是否正常，並判斷是否與預期結果相同。
4.3 若PCR膠圖有585bp和355bp兩條bands，則代表此為純品系一般米DNA；若膠圖中有577bp和257bp兩條bands，則為純品系香米DNA；若同時具有585bp、355bp和257bp，則為異型合子的一般米。

5.教學目標與評量

5.1 了解香米具有香氣的原因是由於BAD2的缺損。
5.2 能熟悉DNA萃取的操作方式。
5.3 能從Nano drop的結果判斷DNA品質好壞。
5.4 熟悉PCR和電泳的操作方式。
5.5 能從PCR膠圖判斷樣品的種類。

6.參考資料：

7.參考說明：

萃取DNA膠圖

PCR膠圖