植物防疫挑戰 如何精準檢驗植物病毒

植物防疫挑戰 ――如何精準檢驗植物病毒

原始設計者：彰師大

學習病毒檢測候選目標基因選定，以及植物病毒候選目標基因引子設計方法。

實驗材料:

• 葉片 數片
• 1.5 ml 離心管 3/個
• 廢液杯 1/個
• 離心機 1/個
• tip 1/個
• Rank 1/個
• 電子秤 1/個
• 打洞器 1/個
• 微量離心管 1/個
• Master mix(Taq, buffer, dNTP, dye) 10/µL
• TE buffer 100/ml
• Primer F’ 4/µL
• Primer R’ 4/µL
• ddH2O 1/µL
• PCR machine 1/台
• 電泳槽 1/台

1.現象說明：

1.Potato virus 馬鈴薯微嵌紋病毒

病毒顆粒為絲狀彎曲 ( Transmission electron micrographs)。PVX 感染茄科植物其病徵表現主要為系統性，感染藜科（Chenopodiaceae）或莧科（Amaranthaceae）後會造成局部性病斑（local lesions），也會感染部分豆科植物（Leguminosae）。
病徵：

• 潛伏感染，並無明顯症狀
• 輕微：斑駁
• 嚴重：
  • 皺葉嵌紋
  • 植株矮化
  • 新生葉片小化
  • 植株頂端、塊莖大量壞疽，植株死亡

　

2.Tobacco mosaic virus 煙草嵌紋病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵：

• 葉部呈現不規則之暗綠色與淡綠嵌紋，嵌紋邊緣多為波浪狀

• 葉片細胞壞疽

• 葉片向下捲曲
  • 在菸草(Nt)過敏反應(NN vs nn)

　

3.Tomato leaf curl Taiwan virus 台灣番茄捲葉病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器，故又稱「濾過性病毒」，引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」，為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵：

• 花枯萎現象
• 植株嚴重矮化
• 片明顯朝上捲起、變形
• 從葉緣及中肋附近區域明顯黃化現象
• 罹病植株結果很少；開花期以前罹染此病毒幾乎無法結果

2.探究問題：（此為引導，學習者必須要提出合理的假說）

• 2.1 何謂cDNA？
• 2.2 為什麼引子的設計須符合AT:GC=1:1？

3.實作項目

• 3.1.至NCBI BLAST選取目標基因 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

• 3.2 下載cDNA (Download cDNA)

• 3.3 找起始密碼子ATG 終止密碼子TGA (Find ATG, TGA)

• 3.4 設計前置引子 (Design primers Forward (AT:GC 1:1  ; GC tail; 5’-3’; 20 mer))

• 3.5 設計反置引子 (Design primers Reverse (https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html))

• 3.6訂製引子 (Order primers)

• 3.7 備製100、10 及 1 uM 的引子 (Preparation of primer stock 100, 10 and 1 uM)

練習：

4.分析與結論

• 4.1
• 4.2
• 4.3

5.教學目標與評量

• 5.1 了解引子在PCR中的運作
• 5.2 學習如何設計引子
• 5.3 能選定檢測的目標基因