"植物防疫挑戰 如何精準檢驗植物病毒" 修訂間的差異

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==1.現象說明: ==
 
==1.現象說明: ==
  
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==2.探究問題:(此為引導,學習者必須要提出合理的假說) ==
 
==2.探究問題:(此為引導,學習者必須要提出合理的假說) ==
  
*2.1 病毒如何感染植物?
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*2.1 何謂cDNA?
*2.2 植物病變的成因可能有哪些?
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*2.2 為什麼引子的設計須符合AT:GC=1:1?
*2.3 如何辦別植物病變的原因?
 
  
 
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==3.實作項目 ==
 
==3.實作項目 ==
<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e3/Experimental_methods.png' width='700px' height='130'>
 
 
1.萃取DNA:
 
 
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*1. 利用打洞器裁出 3-5 mm直徑的葉片
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*3.1.至NCBI BLAST選取目標基因 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
 
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*2. 將 1 片葉片放入1.5 ml離心管中,加入100 μl 溶劑
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*3.2 下載cDNA  (Download cDNA)
**註:不要研磨葉片
 
 
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*3. 65 ℃加熱5分鐘  98 ℃加熱2分鐘
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*3.3 找起始密碼子ATG 終止密碼子TGA    (Find ATG, TGA)
 
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*4. 置於冰上2分鐘
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*3.4 設計前置引子  (Design primers Forward  (AT:GC 1:1  ;  GC tail; 5’-3’; 20 mer))
 
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*5. 所得液體即為萃取液
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*3.5 設計反置引子  (Design primers Reverse (https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html))
 
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*6. 進行濃度測定
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*3.6訂製引子  (Order primers)
 
 
<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/98/Extraction_of_dna.jpg' width='700px' height='150'>
 
 
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*3.7 備製100、10 及 1 uM 的引子  (Preparation of primer stock 100, 10 and 1 uM)
 
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2.PCR:
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練習:
 
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加19 ml混合液於PCR tube後,再加1 ml DNA
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<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/9f/TLCTWV_cDNA.jpg' width='1000px' height='450'>
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<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c1/PCR-Polymerase_Chain_Reaction.jpg' width='1000px' height='400'>
 
 
 
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<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/52/Method_Electrophoresis.jpg' width='800px' height='450'>
 
 
 
3.電泳:
 
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*1.Marker加入2 ml
 
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*2.控制組與實驗組分別加入5 ml
 
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*3.設定電壓與時間,95V 跑 35分鐘
 
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*4.外染
 
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*5.利用UV光照膠
 
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<img src='https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/Electrophoresis_photo.jpg' width='900px' height='450'>
 
  
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==4.分析與結論 ==
  
 +
*4.1
 +
*4.2
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*4.3
  
 
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==4.分析與結論 ==
 
*4.1 由電泳膠圖可判斷植物是否感染病毒
 
*4.2 由電泳膠圖可判斷樣品之分子量大小
 
  
  
 
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==5.教學目標與評量 ==
 
==5.教學目標與評量 ==
*5.1 能熟悉DNA萃取的操作方式。
 
*5.2 熟悉PCR和電泳的操作方式。
 
*5.3 能從PCR膠圖判斷樣品的種類。
 
 
 
  
 +
*5.1 了解引子在PCR中的運作
 +
*5.2 學習如何設計引子
 +
*5.3 能選定檢測的目標基因
  
  

於 2020年11月28日 (六) 02:57 的最新修訂

植物防疫挑戰 ――如何精準檢驗植物病毒

原始設計者:彰師大

學習病毒檢測候選目標基因選定,以及植物病毒候選目標基因引子設計方法。



實驗材料:

  • 葉片 數片
  • 1.5 ml 離心管 3/個
  • 廢液杯 1/個
  • 離心機 1/個
  • tip 1/個
  • Rank 1/個
  • 電子秤 1/個
  • 打洞器 1/個
  • 微量離心管 1/個
  • Master mix(Taq, buffer, dNTP, dye) 10/µL
  • TE buffer 100/ml
  • Primer F’ 4/µL
  • Primer R’ 4/µL
  • ddH2O 1/µL
  • PCR machine 1/台
  • 電泳槽 1/台





1.現象說明:

1.Potato virus 馬鈴薯微嵌紋病毒

病毒顆粒為絲狀彎曲 ( Transmission electron micrographs)。PVX 感染茄科植物其病徵表現主要為系統性,感染藜科(Chenopodiaceae)或莧科(Amaranthaceae)後會造成局部性病斑(local lesions),也會感染部分豆科植物(Leguminosae)。
病徵:

  • 潛伏感染,並無明顯症狀
  • 輕微:斑駁
  • 嚴重:
    • 皺葉嵌紋
    • 植株矮化
    • 新生葉片小化
    • 植株頂端、塊莖大量壞疽,植株死亡
 


2.Tobacco mosaic virus 煙草嵌紋病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器,故又稱「濾過性病毒」,引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」,為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵:

  • 葉部呈現不規則之暗綠色與淡綠嵌紋,嵌紋邊緣多為波浪狀
  • 葉片細胞壞疽
  • 葉片向下捲曲
    • 在菸草(Nt)過敏反應(NN vs nn)
 


3.Tomato leaf curl Taiwan virus 台灣番茄捲葉病毒

人類第一個成功分離出的病毒 以通過濾過器,故又稱「濾過性病毒」,引起的病害稱「病毒病」、「毒素 病」,為介於生物與非生物之間的病原體。
病徵:

  • 花枯萎現象
  • 植株嚴重矮化
  • 片明顯朝上捲起、變形
  • 從葉緣及中肋附近區域明顯黃化現象
  • 罹病植株結果很少;開花期以前罹染此病毒幾乎無法結果



2.探究問題:(此為引導,學習者必須要提出合理的假說)

  • 2.1 何謂cDNA?
  • 2.2 為什麼引子的設計須符合AT:GC=1:1?





3.實作項目



  • 3.2 下載cDNA (Download cDNA)


  • 3.3 找起始密碼子ATG 終止密碼子TGA (Find ATG, TGA)


  • 3.4 設計前置引子 (Design primers Forward (AT:GC 1:1  ; GC tail; 5’-3’; 20 mer))



  • 3.6訂製引子 (Order primers)


  • 3.7 備製100、10 及 1 uM 的引子 (Preparation of primer stock 100, 10 and 1 uM)


練習:



4.分析與結論

  • 4.1
  • 4.2
  • 4.3




5.教學目標與評量

  • 5.1 了解引子在PCR中的運作
  • 5.2 學習如何設計引子
  • 5.3 能選定檢測的目標基因




6.參考資料:





7.參考說明: